Πλήρης Αλληλούχιση Γονιδίων α- & β-θαλασσαιμίας (HBA1/HBA2 & HBB) & Ανάλυση MLPA β-συμπλέγματος

Με τη μεθοδολογία της μαζικής παράλληλης αλληλούχισης (massive parallel sequencing) των γονιδίων HBA1/HBA2 ανιχνεύονται μονονουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNVs), εισαγωγές/διαγραφές (indels), παραλλαγές μεγάλου αριθμού βάσεων (CNVs) και δομικές παραλλαγές (SVs) με την τεχνολογία long read sequencing στην πλατφόρμα MinION του οίκου Oxford Nanopore Technologies με χημεία της εταιρείας Asuragen. Τα ευρήματα που αφορούν σε CNVs των γονιδίων του συμπλέγματος α-σφαιρίνης (HBZ, HBZP1, HBAP2, HBAP1, HBA2,  HBA1 & HBQ1) επιβεβαιώνονται με τη μέθοδο MLPA, χρησιμοποιώντας το kit SALSA MLPA Probemix P140-C1 από την εταιρεία MRC-Holland και τον αναλυτή SeqStudio Genetic Analyzer. Η μέθοδος δεν ανιχνεύει σημειακές μεταλλάξεις, ενώ η ανίχνευση παθογόνων/ πιθανώς παθογόνων σημειακών μεταλλάξεων επιβεβαιώνεται με αλληλούχιση κατά SANGER χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια της εταιρείας ThermoFisher Scientific και τον αναλυτή SeqStudio Genetic Analyzer.

Η αλληλούχιση του γονιδίου ΗΒΒ πραγματοποιείται με την τεχνολογία long read sequencing στην πλατφόρμα MinION του οίκου Oxford Nanopore Technologies με χημεία της εταιρείας Asuragen, η οποία καλύπτει την ανίχνευση SNVs και indels για την κωδικοποιούσα περιοχή του γονιδίου HBB, αλλά και CNVs και SVs για το γονίδιο HBB. Για την πληρέστερη κάλυψη του γονιδίου και την ανίχνευση των  CNVs των γονιδίων του συμπλέγματος β σφαιρίνης (HBE1, HBG2, HBG1, HBD & HBB) χρησιμοποιείται η μέθοδος MLPA, με το kit SALSA MLPA Probemix P102-D1 από την εταιρεία MRC-Holland και τον αναλυτή SeqStudio Genetic Analyzer. Η μέθοδος δεν ανιχνεύει σημειακές μεταλλάξεις.

Ταυτόχρονα, η ανίχνευση παθογόνων/ πιθανώς παθογόνων σημειακών μεταλλάξεων επιβεβαιώνεται με αλληλούχιση κατά SANGER χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια της εταιρείας ThermoFisher Scientific και τον αναλυτή SeqStudio Genetic Analyzer.

Ωστόσο, σημειακές μεταλλάξεις στην προς εξέταση περιοχή, δύνανται να επηρεάσουν τον υβριδισμό των ανιχνευτών μειώνοντας το αναλυτικό σήμα φθορισμού τους και στις δύο επιβεβαιωτικές μεθόδους.

Παρατηρήσεις

Το kit της Asuragen, που χρησιμοποιείται, καλύπτει με δυο αμπλικόνια τα γονίδια HBA1 και HBA2 (ένα για κάθε γονίδιο). Επιπλέον, με 12 αμπλικόνια καλύπτει την περιοχή του άλφα συμπλέγματος σφαιρίνης προκειμένου να διαφοροποιηθούν οι γνωστές δομικές παραλλαγές. Οι μονονουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNVs), και οι εισαγωγές/διαγραφές (indels) αναφέρονται μόνο στα γονίδια HBA1 και HBA2.

Ακόμα, η παθογόνος μετάλλαξη HBA2:c.*93_*94del στην 3’ UTR προκαλεί απώλεια ενίσχυσης του αντίστοιχου αμπλικονίου του HBA2. Η παρουσία αυτής της μετάλλαξης θα οδηγήσει στην απώλεια αριθμού αντιγράφων του HBA2. Όσον αφορά τις παραλλαγές μεγάλου αριθμού βάσεων (CNVs) και τις δομικές παραλλαγές (SVs), το πλήρες σύνολο των αμπλικονίων σε όλη την περιοχή του άλφα συμπλέγματος επιτρέπει τη διαφοροποίηση 10 κοινών δομικών παραλλαγών: MED-I, MED-II, THAI, FIL, alpha20.5, SEA, 4.2del, 3.7del, anti-4.2, και anti-3.7.

Σπάνιες δομικές παραλλαγές μπορεί να προκαλέσουν τα ίδια αποτελέσματα με μία από τις 10 κοινές δομικές παραλλαγές λόγω του σχεδιασμού των αμπλικονίων. Σε περίπτωση διαγραφής γονιδιακής περιοχής που βρίσκεται ο εσωτερικός μάρτυρας, υπάρχει πιθανότητα αύξησης του σήματος του αριθμού αντιγράφων σε όλα τα αμπλικόνια. Αλλαγές στον αριθμό αντιγράφων που προκύπτουν από διαγραφές και διπλασιασμούς του άλφα συμπλέγματος σφαιρίνης και επηρεάζουν τις ενδογενείς περιοχές ελέγχου και τα γονίδια HBA δεν θα ανιχνεύονται από το software Amplidex One Reporter. Επίσης, αναφέρονται δομικές παραλλαγές εντός αμπλικονίου > 50 bp.

Επιπροσθέτως, η πλήρης κάλυψη των εξονίων του γονιδίου HBB για τα SNVs και indels (δεν καλύπτει ιντρόνια και την περιοχή του εκκινητή) επιτυγχάνεται μέσω δύο αμπλικονίων (Exon01-02 και Exon03, ενώ ολόκληρο το γονίδιο του HBB καλύπτεται για τα CNVs και SVs. Τα ίδια ενδογενή αμπλικόνια ελέγχου που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση CNVs στα HBA1/2 χρησιμοποιούνται και για την ανίχνευση πλήρους διαγραφής αμπλικονίων στο HBB, ενώ οι διπλασιασμοί εξονίων δεν αναφέρονται.

Το kit αναγνωρίζει την ύπαρξη γνωστών CNVs με την ένδειξη ότι υπάρχει μερική διαγραφή στα αμπλικόνια του HBB,  χωρίς ωστόσο να τα διαφοροποιεί εξ ολοκλήρου καθώς δεν καλύπτει και τα υπόλοιπα γονίδια του συμπλέγματος της β σφαιρίνης. Σε περίπτωση διαγράφης γονιδιακής περιοχής που βρίσκεται ο εσωτερικός μάρτυρας, υπάρχει πιθανότητα αύξησης του σήματος του αριθμού αντιγράφων σε όλα τα αμπλικόνια. Αν ολόκληρο το άλφα σύμπλεγμα σφαιρίνης διπλασιαστεί, το σήμα αριθμού αντιγράφων μπορεί να μειωθεί κατά περίπου 33% στο HBB, οπότε μπορεί να παρατηρηθεί ψευδής αναφορά διαγραφής ενός ή και των δύο αμπλικονίων του HBB. Αναφέρονται, ακόμα, δομικές παραλλαγές εντός αμπλικονίου >50 bp. Πολύ μεγάλες διαγραφές, που εκτείνονται στο μεγαλύτερο μέρος ενός αμπλικονίου, έχουν παρατηρηθεί ότι οδηγούν σε πλήρη διαγραφή του αμπλικονίου.

Δεν είναι δυνατή η ανίχνευση νουκλεοτιδικών αλλαγών ή απαλοιφών/ενθέσεων σε ρυθμιστικές ή ιντρονικές περιοχές, πέραν των αναφερθέντων στη μεθοδολογία, καθώς και γονιδιακών αναδιατάξεων. Σε σπάνιες περιπτώσεις ενδέχεται να μην ανιχνευθεί μια παραλλαγή της αλληλουχίας λόγω πιθανής παρουσίας νουκλεοτιδικής αλλαγής στην περιοχή υβριδισμού των εκκινητών/ιχνηθετών. Η εξέταση θεωρεί ότι το αρχικό υλικό και το DNA του δείγματος ανήκει στον/στην ασθενή, και ότι το αποτέλεσμα είναι συγκεκριμένο μόνο για αυτό το δείγμα.

Όσον αφορά τον έλεγχο της αναλυτικής ευαισθησίας και ειδικότητας χρησιμοποιήθηκε το Positive Control  του Coriell Institute for Medical Reasearch, HG03366, ως δείγμα αναφοράς, το οποίο είναι σχεδιασμένο να παρακολουθεί την ανίχνευση 3 μεταλλάξεων (HBA2:a^-3.7/a^-3.7. HBA1:c .207C>G, HBB:c.20A>T).

Η αναλυτική ευαισθησία και ειδικότητα για την ανίχνευση ελλείψεων και διπλασιασμών μεγάλου αριθμού βάσεων με το kit της MRC Holland είναι πολύ υψηλή όμως μπορεί να επηρεαστεί όταν SNVs ή άλλοι πολυμορφισμοί βρίσκονται στην αλληλουχία στόχο του DNA, λόγω μη καθαρότητας του δείγματος  DNA , ατελούς αποδιάταξης DNA του δείγματος, χρήσης μη επαρκούς ή υπερβολικής ποσότητας του δείγματος  DNA και λόγω τεχνικών προβλημάτων. Το MLPA δεν μπορεί να ανιχνεύσει σημειακές μεταλλάξεις στην περιοχή ανίχνευσης, αλλαγές που βρίσκονται εκτός της αλληλουχίας στόχου των ανιχνευτών καθώς και αναστροφές ή/και μετατοπίσεις που δεν επηρεάζουν τον αριθμό αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου.